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免疫沈澱沒有它無法實現

发布时间:2021-1-4 17:17:46??????点击:

  今天要來講講離心機在免疫沈澱方面得重要性。

  據了解染色質免疫沈澱簡稱ChIP用來研究DNA上的特定蛋白質。

  而RNA免疫沉淀法(RIP)和ChIP相近,但RNA免疫沉淀法是用来研究会与RNA结合的蛋白质(RNA Binding ProteinImmunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,利用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,通过離心機分离纯化,对结合在复合物上的RNA 进行RT-PCR验证或测序分析,了解转录后调控网络动态过程,是研究转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

  RIP這種新興的技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沈澱下來,然後經過分離純化就可以對結合在複合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沈澱ChIP技術的類似應用,但由于研究對象是RNA-蛋白複合物而不是DNA-蛋白複合物,RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同(如複合物不需要固定,RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶,抗體需經RIP實驗驗證等等)。

  RIP技術下遊結合microarray技術被稱爲RIP-Chip,幫助我們更高通量地了解癌症以及其它疾病整體水平的RNA變化,結合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。

  免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,通过離心機离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

  免疫共沈澱是以抗體和抗原之間的專一性作用爲基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法,是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。

  免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。

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  操作步驟

  1.一般起步使用2個10cm2皿,用預冷的PBS洗滌細胞三次,最後一次吸幹PBS;

  2.加入細胞裂解液(western及IP裂解液)裂解細胞,使蛋白終濃度在1-7mg/ml;

  3.4°离心10min,去除细胞碎片;注意这里需要用到冷冻離心機,因为温度上有严格要求。

  4.根據樣品量加入0.5-2ug左右抗體,4℃,旋轉過夜。

  5.取10-30ul protein A/G 的beads于EP管中,弃上清,使用PBS洗涤beads一次。

  6.將樣品加入EP管,4度垂直混勻2-3h。(在吸取瓊脂糖珠的時候,注意要搖勻管子,讓珠子和溶液混合均勻,同時黃槍頭要減掉頭子再吸取,以免破壞珠子),PBS洗脫;4度離心,棄上清,

  7.洗脫三次,酌情用PBS/PBST/高鹽溶液洗瓊脂糖珠,最後一次吸幹洗滌液。

  8.将适量相应抗体的多肽或0.1M PH2.8的甘氨酸稀释到细胞裂解液中,混匀,取适量于beads中进行洗脱,去除轻重链。若用甘氨酸HCL,样品需要用NaOH中和,根据C1V1=C2V2计算加入NaOH的含量。

  9.通过離心機离心取上清,制样,跑胶。

  以上就是关于離心機在免疫沉淀方面得讲解,现在您知道“免疫沈澱沒有它無法實現”中得"它"说的是什么了吧!


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