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菌體或者細胞裂解法中哪些需要用到離心機

发布时间:2021-9-22 17:9:30??????点击:

  離心機在菌體或者細胞裂解法中都會應用到。

  今天就例舉幾個常見的方法,進行簡單得彙總:

  一、反複凍融法:

  1、將細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反複幾次,由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎。

  2、至少3次以上凍溶。

  3、IFCC推薦法:

  收集细胞悬液,将離心機设置4℃低温离心(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS(200ul),轻轻吹打混匀,-200C 冷冻30 min,370C 解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液。

  4、用液氮凍融三四次就可以了,細胞凍住後,取出放37度水浴,溶解後震蕩,再凍。

  二、超聲波處理法

  1、要設定好超聲時間和間隙時間,一般超聲時間不超過5秒,間隙時間最好大于超聲時間,這些都有利于保護酶的活性。我的實驗超聲時間5秒、間隙時間10秒、工作次數20次。

  2、每個樣本超聲時間5秒,每個間隔5秒,粉碎5次。

  3、100ml菌液用離心機离心,用8ml缓冲液悬浮,加8mg溶菌酶,冰浴30min,然后超声处理。750W 40%功率。5秒超声,9秒间隔。超声至少90min。

  4、綜合凍融和超聲的方法:

  1500g離心,棄除上清。冰上,用小體積PBS重懸細胞。

  將重懸液集中,1500g離心濃縮,棄除上清。液氮驟冷。用約5倍體積的PBS緩沖液重懸細胞,並攪拌。

  可選擇:4℃下超聲破碎細胞。加入終濃度爲0.25M的KCl,15mM的DTT。4℃下111500g×60min離心裂解液。取出上清。過柱子。

  三、裂解液處理法:

  1、细胞裂解液:50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2% SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

  2、在loading buffer加SDS,100度5分钟,是变性方法。SDS与蛋白等量结合,可以通过条带位移判断蛋白大小,考染不会影响结果。

  3、如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可,需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟,然后上样时,枪头别吸最底下的。

  4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0),4 ml 10% SDS,1 ml 1M Tris-cl(PH6.8),14.96 ml 蒸馏水。

  5、我始終未明白樓主如果想收集全蛋白,而不考慮包涵體的話,爲何要用超聲呢?直接水煮不就可以了嗎?

  6、将1ml菌通过離心機离心弃上清,留大概50ul,再加50ul 2×上样缓冲液,煮10min,取20ul上样,就可以了。

  7、檢測蛋白誘導:

  从培养的不同时期各取出1ml,12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液(50mM Tris-Cl(pH6.8),100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油)中,100℃加热3min,然后12000g×1min离心。上样15ul,6%SDS-PAGE电泳。

  《分子克隆》P826

  8、5-10秒离心,弃除上清,用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF,再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液(100℃加热)。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置(或-20℃放置),然后再溶解,煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。

  2×SDS上样缓冲液:250mM Tris-Cl,6.2%(w/v)DTT,8%SDS,0.002%(w/v)溴酚蓝,40%甘油。

  Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

  9、裂解液:50mMTris-HCl(pH8.5~9.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。

  10、我们用NP40(NP40:NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇,是一种非离子表面活性剂。)加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞,冰上放30-60min,然后13000rpm离心15min,取上清定量。

  11、裂解液配方是:50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0),150mmol/L NaCI,0. 02% 叠氮钠,100μg/ml PMSF,1μg/ml Aprotinin,1% Triton X-100 ( or NP-40)。

  12、对于组织培养中生长的细胞,最有效的裂解方法是用去污剂(表面活性剂)进行处理,溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ,这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。

  13、細胞裂解液的主要目的:(1)利用去汙劑破壞脂質雙分子層,破裂細胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白變性使其穩定;(4)抑制蛋白酶活性。

  推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 ?g/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 ?g/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。

  14、裂解buffer:50mM HEPES pH7.0,1mM 甘油,1mM DTT(还原剂),7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),1mM EDTA(金属鏊合剂),1mM PMSF,1mg/ml leupeptin,1mg/ml aprotinin,1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂),50mM NaF(ph7.0)(anti hemoaggulating),1mM Na3VO4(ph7.0)(inhibitor of phosphatases),2mM benzamidine(inhibitor of trypsin)。

  15、可选择:取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清,用100ul 1×SDS上样缓冲液重悬,冰上放置。

  6000rpm×10min離心培養物。棄除上清,用10ml預冷的裂解液重懸沈澱。液氮驟冷細胞或-20℃冷凍細胞。在冷水中溶解細胞。15秒、4次超聲處理細胞。冰浴降溫。4℃,9000g×30min離心。取上清。

  裂解液:5 mM DTT,15 mM KCl,5 mM MgCl2,50 mM HEPES, pH 7.9,1 mM EDTA,10 mg/ml溶菌酶(临用前加上DTT和溶菌酶)。

  Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol

  16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100 ?g/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (终浓度1.5%),然后超声波破碎。16000 rpm×30 min离心。取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA?琼脂糖柱层析。

  以上就是关于離心機在一些常见实验中得应用,如果您还想了解更多有关应用知识,可以来上海盧湘儀離心機儀器有限公司,与我司相关技术人员交流探讨。


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