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血清分離實驗哪能少的了它

发布时间:2021-3-31 18:30:55??????点击:

  離心機被廣泛應用于血清分離實驗。

  血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成,各行使其重要的功能。

  血液完全凝固和离心条件是至关重要的两个环节,离心要求采用水平式離心機。具体操作步骤是:采血后立即轻轻倒转采血试管4~5次混匀标本,等待标本充分凝固需要放置30min,离心半径200px,離心機离心速度维持在3500~4000r/min离心10min。血清与血凝块完全被分离胶分离,血清标本可直接上机检测或转移至仪器配套试杯中。具备这个条件才能制备出高品质血清标本,说明分离胶效果好。

  鹽析後蛋白質沈澱經水溶後,特點是保持蛋白質生物學活性,因此,鹽析法是研究蛋白質分子的結構和功能的最常用方法。除鹽析法,有機溶劑沈澱法、等電點沈澱法、柱層析法和超速離心法等也是蛋白質分離的常用方法。

  實驗器材和試劑

  1.器材:10ml具塞刻度试管、離心機、离心管、小试管、5ml吸管、滴管2支、培养皿3套、醋酸纤维薄膜、点样器、电泳槽、电泳仪、1.0×20cm层析柱。

  2.試劑:

  (1) 葡聚糖凝胶Sephadex G-25:称10g SephadexG-25,加200ml 0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

  (2) 生理盐水:称取分析纯NaCl  0.89g,蒸馏水稀释至100ml。

  (3) 饱和硫酸铵溶液:25℃时称取(NH4)2SO4约767g,溶解至1000ml蒸馏水中,至不能完全溶解为止,即为饱和硫酸铵溶液。

  (4) 巴比妥缓冲液(pH 8.6):称取巴比妥钠15.458g.巴比妥2.768g,蒸馏水定容至1000m1。

  (5) 氨基黑10B染色液:称取氨基黑10B 0.5g,加入100ml漂洗液不断振摇,直到完全溶解。

  (6) 漂洗液:取95%乙醇450ml,冰醋酸100m1,混匀后,用蒸馏水稀释到l000ml。

  鹽析沈澱蛋白質:

  取10 m1具塞刻度试管1支,加入血清溶液 2.5ml,缓慢加进等量饱和(NH4)2SO4溶液,充分摇匀,见有沉淀析出,静置10min,用双层滤纸过滤,弃去沉淀,取滤液。

  蛋白質分子能穩定存在于水溶液中是因爲有兩個穩定因素:水化膜和表面電荷。當維持蛋白質的穩定因素破壞時,蛋白質分子可相互聚集沈澱而析出,蛋白質分子沈澱析出的方法很多,根據對蛋白質穩定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機溶溶劑法、重金屬鹽法以及生物堿試劑法等。鹽析法是以中性鹽如硫酸铵((NH4)2SO4)等對蛋白質作用破壞蛋白質表面水化膜而使蛋白質相互聚集而析出。不同的蛋白質沈澱需要的中性鹽濃度不同,在不同鹽濃度下,蛋白質溶解度不同。球蛋白在半飽和狀態下發生沈澱,而請蛋白在完全飽和狀態下沈澱,利用此特性可把蛋白質分段沈澱下來,此種鹽析法稱分段鹽析。

  此次實驗注意事項:

  1、只有经过严格培训的人员才能进行離心機操作。

  2、操作時應戴手套以及眼睛和黏膜的保護裝置。

  3、規範的實驗操作技術可以避免或盡量減少噴濺和氣溶膠的産生。血液和血清應當小心吸取,而不能傾倒。嚴禁用口吸液。

  4、移液管使用後應完全浸入適當的消毒液中。移液管應在消毒液中浸泡適當的時間,然後再丟棄或滅菌清洗後重複使用。

  5、帶有血凝塊等的廢棄標本管,在加蓋後應當放在適當的防漏容器內高壓滅菌和/或焚燒。

  6、應備有適當的消毒劑來清洗噴濺和溢出標本。


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